实验标本的采集/处理和保存

实验标本的采集/处理和保存


一 血清

1 采血后室温静置20min或更长时间至血清析出。

2 将采集的血液用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

大部分检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP为标记的测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染,因为菌体中可能含有含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。


二 血浆

1 取血后加入抗凝剂(EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠等),混合10-20分钟后,30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染(也可以直接用抗凝管采集)。

2 将采集血液用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

注意事项:制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求,建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。


三 尿液

1 采集尿液样本500ul,加入无菌试管中。

2 用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的样本小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。


四 细胞培养上清

1 用无菌试管收集细胞培养上清液。

2 用离心机4℃,2000rpm离心15min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。


五 细胞裂解液

1 取细胞培养板或细胞悬液,用PBS(PH7.2-7.4)洗涤细胞培养板1-2次。

2 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂(裂解液),使细胞破坏并放出细胞内成份。

3 用离心机4℃,2000rpm离心20min左右,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

4 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。


六 组织匀浆

1 采集组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。

2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86%冷生理盐水,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块(天热时操作要在冰水浴中进行,将盛有组织的小烧杯放入冰水中)。

3 匀浆的方式有多种:

a) 手工匀浆:将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使组织匀浆化。

b) 机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间10秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行),皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

c) 超声粉碎:用超声粉碎机进行粉碎,可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎,也可用国产超声波发生仪,用40安培,5秒/次,间隙10秒反复3~5次。

4 将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000rpm离心15min,将离心好的匀浆小心收集上清,弃下面沉淀。

5 取上清并分装保存备用,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。


保存时间

一般检测样本在2-8℃下,可放置保存24-48小时;-20℃下,可放置保存1个月;-70℃下,可放置保存6个月。

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RayBiotech组织裂解步骤

一、裂解液的配制

1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。

2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail (蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。

3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980u1的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/组织裂解液,备用。


注:如果非RayBiotech的裂解液,可以使用商业化的细胞/组织裂解液,按照说明书操作即可。


二、组织裂解

4 将配制好的细胞/组织裂解液和1*PBS在冰上预冷;

5 从-80度冰箱取出冰冻组织,取10mg组织,用手术剪刀将其剪碎至1-3 mm3,转移至2ml离心管,加入500ul细胞裂解液,置冰上保持低温,匀浆机裂解组织,30s--5min (根据具体组织而定)。

6 冷冻离心机离心14000rpm 10min:

7 取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;

8 干冰邮寄


注:采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液,蛋白浓度至少大于2mg/ml。


RayBiotech细胞裂解步骤

1 将2X Cell Lysis Buffer稀释2倍备用,用蒸馏水或者双蒸水稀释。

2 配制Protease Inhibitor Cocktail:将Protease Inhibitor Cocktail (蛋白酶抑制剂)小管简单离心,然后将盖子打开,加入60ul稀释好的1X Cell Lysis Buffer在小管中,混匀溶解蛋白酶抑制剂。

3 取20ul配制好的蛋白酶抑制剂,加入到1980ul的1X Cell Lysis Buffer中,混匀,即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞裂解液,备用。

4 将配制好的2ml细胞裂解液和1*PBS在冰上预冷;

5 将细胞板放在冰上进行细胞裂解;

6 用1*PBS将细胞清洗3次,弃去1*PBS,最后一次要彻底吸干1*PBS;

7 加入200-500ul裂解液,然后将细胞刮下来,收集到EP管中;

8 将EP管在冰上放置30min,每隔5-10min涡旋摇匀30s;

9 冷冻离心机离心14000rpm 10min;

10 取上清,分装后在-80度冻存,避免反复冻融;

11 干冰邮寄


PS:也可以将悬浮细胞离心收集细胞沉淀,然后加适量裂解液进行裂解:


注:如果非RayBiotech的裂解液,可以使用商业化的细胞/组织裂解液,按照说明书操作即可。

采用蛋白定量试剂盒定量制备的组织裂解液,蛋白浓度至少大于2mg/ml。