biotechne产品使用常见技术问题解答- Novus Biologicals®产品特异问题

2.3 Novus Biologicals®产品特异问题

Novus Biologicals®品牌质保原则 Novus Biologicals®抗体产品页面中列出的所有种属（Species）及应用(Application)均受到质保。除Novus Biologicals®自身验证过的种属及应用外，部分列出种属及应用是根据种属同源性预测、引用文献报道或者客户Review。虽然Novus Biologicals®自身并未验证，只要列在产品页面中（说明书中可能未列出）显示，均属于质保范围。

特别注意：不同于R&D Systems®品牌，NOVUS的IHC与ICC/IF两种应用不能相互质保。若有单独标志IHC的子类（IHC-Fr、IHC-P或IHC-Whole Mount），只质保单独标志的子类，如果只有IHC标志而无子类标志，则质保所有的IHC子类。若有(-) 标志，代表验证过为阴性的种属或者应用，此类也不属于质保范围。

NOVUS质保举例：抗体A标注了IHC，则可以质保IHC-P，IHC-Fr，不能质保ICC/IF；抗体B标注了IHC，IHC-Fr则可以质保IHC-Fr，不能质保IHC-P及ICC/IF；抗体C标注了ICC/IF则可以质保ICC/IF，不能质保IHC-P及IHC-Fr。

Novus Biologicals®抗体可以针对未经测试的应用或物种使用吗? 我们的创新奖励计划Innovator's Reward™目的是为客户的创新研究提供最小的经济风险。如果您决定将我们的产品用于未经测试的应用或物种，Novus Biologicals®将奖励您100%产品价格的抵扣券（Voucher）用于下次产品的购买。只需要联系专用邮箱： innovators@novusbio.com 申请，我们会寄给您一份表格，以便提交您的研究总结和实验结果，之后您将获得抵扣券奖励。您也可以通过在线提交一份评论（Review），详细说明您对未经测试物种使用产品获得的阳性/阴性结果。Novus Biologicals®验证图像数据并审核评论后，将奖励您一份购买价格100%的优惠券，供您下次购买产品时使用。

为何Novus Biologicals®产品的示例图与其他厂家产品的示例图一样？ 我司的产品除自产外，也销售其他供应商提供的产品。我们确保所有产品页面的示例图均来自实验室验证、供应商授权的原始数据或者来自客户的引用文献及Review数据。

为什么有些腹水(单克隆)或抗血清(多克隆) 抗体产品没有浓度信息? 我们无法确定这些抗体产品的浓度是因为未经纯化（Unpurified）的腹水和抗血清含有其他血清蛋白/免疫球蛋白，导致我们无法准确测量。因此，准确的抗体浓度通常只与纯化的抗体有关。

货号中带PEP是抗体吗？能用做WB应用吗？ Novus Biologicals®中常规货号+PEP的产品通常为针对常规货号抗体的阻断抗原，例如NBP1-80929PEP就是特异阻断抗体产品 NBP1-80929的抗原。通常用于抗体的竞争检测。需要注意的是本抗原除阻断对应抗体外的任何其他应用均由使用者承担风险。此产品为仅供研究使用（RUO），严禁将本产品用于商业生产。

2.4 Application 应用相关问题

能否提供抗体常见应用（WB, ICC/IF, ChIP）的protocol及演示视频? 我司官方微信公众号RnDSystems（互动达人-资料下载/操作视频）及Bilibili（UID:509961500）上有抗体常见应用的protocol及演示视频。

此抗体的最佳工作浓度是多少? 产品网页和数据为大多数验证的应用提供了一个推荐浓度，可以作为滴定起点。由于其他变量的影响，不同的实验室所需抗体的浓度也不同，因此强烈建议采用滴定法进行预实验来优化结果。

此抗体能够用于体内实验（In vivo）吗? 我们的产品不进行任何体内实验验证。因为体内实验较为复杂，需要考虑动物的异质性、抗体的活性、半衰期、免疫原性、内毒素等多种影响因素，因此我们不能保证抗体产品体内实验一定有效性。若需要进行体内实验，可以通过对应产品页面中的“引用” （Citation）栏寻找相关文献参考，并自行进行预实验。

当我在小鼠组织上使用小鼠一抗时，我应该使用Fab特异性二抗吗? F(ab)特异性二抗可以避免非特异性结合组织中的IgG蛋白从而降低背景信号。需要确保目的一抗有一个暴露的F(ab) 片段供二抗结合。如果没有，你可以在一抗孵育前使用Mouse-on-Mouse封闭试剂或抗小鼠IgG二抗（未偶联的裸抗）作为降低背景信号的替代方法。

5%的脱脂牛奶稀释过的二抗能储存多久? 稀释过的二抗，其半衰期受到使用次数、储存温度、储存缓冲液的新鲜程度和其他处理因素影响。我们建议尽量原管保存二抗，只取出够单次实验使用的量。如果您决定储存预稀释的二抗，你可能需要使用相应一抗对二抗进行稳定性测试。虽然我们对我们的产品提供100%的保证，但我们不建议在抗体稀释液中储存抗体。

对Western Blot中使用的封闭液有什么建议吗? 我们的Western Blot QC验证中经常使用的封闭液为3% BSA或5% 脱脂奶粉溶解于TBST缓冲液中。针对翻译后磷酸化修饰的抗体，请使用BSA作为封闭液。这是为了避免抗体非特异性地与脱脂奶粉中的酪蛋白结合而带来的高背景。

如何寻找合适的阳性对照? 产品说明书中的图像提供了关于潜在阳性对照细胞和/或组织的详细信息，这些细胞和/或组织此前已由实验室进行过抗体验证测试。此外，我们建议通过公认的文献以及一些数据库例如Uniprot或The Protein Atlas寻找高表达目的蛋白的组织或细胞系。

为什么我的免疫荧光染色结果会有斑点? 当使用高浓度/低稀释比时，一些抗体倾向于形成聚集物，从而导致免疫染色试验中产生斑点信号。通过高速离心抗体瓶5-10分钟，然后小心地将上清液/抗体溶液移出，注意不要接触瓶底，可以将聚集物从抗体库中除去。染色斑点的另一个来源是使用不干净的载玻片和/或盖玻片。如果怀疑载玻片或盖玻片上有颗粒物质，请在显微镜下仔细检查后再使用。载玻片可用纯酒精配合纸巾或棉花清洗。

为何在天然样品中观察到的Western Blot条带大小与预测分子量不同? “预测”的分子量完全基于氨基酸序列(或蛋白质的大小)。然而，有许多其他因素可能影响蛋白印迹中实际观察到的大小。蛋白修饰：翻译后剪切将蛋白质前体形式(pro-form)剪切为分子量更小的蛋白质活性形式，或翻译修饰包括蛋白的糖基化(通过N或O糖基化位点)，磷酸化以及泛素化会增加凝胶中蛋白条带的大小。氨基酸组成决定蛋白总的净电荷，通过带负电荷的SDS-PAGE凝胶影响迁移速度。

三聚作用或二聚作用会产生多聚体蛋白质，使用还原条件（Reducing condition）将有助于消除这些相互作用。选择性剪接可能从同一基因产生不同大小的蛋白质（Isoforms）。

为何重组蛋白样品在Western blot中的分子量与细胞或组织裂解液样品不同? 可以观察到差异的原因有很多。重组蛋白可能只含有部分成熟氨基酸序列。重组蛋白的翻译后修饰可能与天然蛋白不同。例如，在大肠杆菌中产生的重组蛋白不会发生糖基化，如果序列中存在糖基化位点，那么在Western Blot中，重组蛋白的大小就会比天然蛋白小。此外重组蛋白中可能包含标签 (例如 His，GST，Fc或者碱性或者酸性尾标签). 检查重组蛋白说明书中来源部分，以确定是否存在标签或其他序列。

如何选择合适的同型对照（Isotype Control）? 选择同型对照或阴性对照时，除了抗体来源物种与测试抗体相同且同类型外，你还需要考虑你检测的物种。同型对照可能针对非天然抗原，不过这种情况并不常见。请注意，适用于人体细胞的同型对照可能不适用于小鼠细胞的实验。同型对照还需要与使用的一抗偶联相同的荧光基团。同型对照推荐通常可以在抗体产品页面的相应菜单中寻找。

荧光素异硫氰酸酯(FITC)的分子量是多少? 荧光素异硫氰酸酯(FITC)的分子量为389.38 道尔顿。不过R&D Systems® 常用的是5-(和6-)羧基荧光素(CFS)进行抗体偶联，CFS 的分子量为473 道尔顿。

R-藻红蛋白 (PE) 的分子量是多少? PE是一种240kDa蛋白，每个分子含有23个藻红素色素团。通常，每个抗体只偶联1个PE分子。

细胞是否可以在染色后在第二天进行流式细胞术分析? 在大多数情况下，如果染色细胞经过固定并适当储存，可以第二天进行分析。

流式细胞术推荐哪些Fc阻断剂? 理想的Fc阻断剂应该是来自与被染色细胞同种的IgG。