Matrigel体外3D细胞培养操作流程

Corning® Matrigel®基底膜基质是提取于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肿瘤的可溶性基底膜，在室温下凝胶形成真正重建的基底膜。Corning Matrigel基质的主要成分是层粘连蛋白（约60％）、IV型胶原蛋白（约30％）、巢蛋白（约8％）和硫酸肝素蛋白多糖。Corning Matrigel基质中也含有生长因子、胶原酶、纤溶酶原激活物及其他成分。

试剂和材料

● MDCK细胞株（ATCC CCL-34，家犬肾上皮细胞）

● Corning Matrigel 基底膜基质（Corning，货号356234）

● MEM培养液（Corning，货号10-009-CV）

● 胎牛血清FBS（Corning，货号35-015-CV）

● 磷酸盐缓冲液PBS (Corning，货号21-040-CV)

● 0.25％胰蛋白酶/ EDTA(Corning，货号25-053-Cl)

● 24孔板（Corning，货号3524）

操作流程1. 胶上3D培养

1. 使用前将Matrigel基质小瓶浸入置于4°C冰箱的冰中过夜解冻。Matrigel解冻后，旋转小瓶以确保混匀。

2. 向预冷的24孔板中加入200μL/孔的Matrigel（8-11mg/mL），用移液枪头迅速均匀铺开，在37℃下孵育30分钟使Matrigel成胶。

    注意：与Matrigel基质接触的所有培养器皿、耗材和培养液均应预冷。整个实验过程中需始终保持Matrigel置于冰上。在Matrigel凝胶过程中不要使其过度干燥。

3. MDCK细胞用PBS洗一次，胰酶消化并制备单细胞悬液，室温下125×g离心5分钟沉淀细胞。

    注意：使用状态良好且不超过85％汇合度的细胞。MDCK细胞易于成团，通常需用移液器吹打以获得单细胞悬液。

4. 用MDCK完全培养液（MEM + 10％FBS）重悬细胞，调节细胞密度至3×105个/ mL，取250μL细胞悬液加入到Matrigel包被的24孔板中，37℃下孵育30分钟。

   注意：接种细胞数量可能需要根据细胞的生长特性进行优化。

5. 冰上冷却MDCK完全培养液，加入终体积10％的Matrigel基质（终浓度：0.8-1.1mg / mL）。取250μL的Matrigel基质/培养液混合物，轻轻加入到24孔板中。

    注意：培养液在加入Matrigel基质之前必须彻底冷却，以确保Matrigel基质混合均匀，并能均匀沉积在培养基中的细胞上。将Matrigel基质/培养液混合物沿孔的侧壁加入，避免扰动细胞和Matrigel基质胶。

6. 继续培养4至7天，每2天更换一次Matrigel基质/培养液混合物。

7. 建议对3D培养物进行免疫染色，使用共聚焦显微镜观察细胞形态。

操作流程2. 嵌入式3D培养

1.     使用前将Matrigel基质小瓶浸入置于4°C冰箱的冰中过夜解冻。Matrigel解冻后，旋转小瓶以确保混匀。

2.     在第0天，用预冷的MDCK完全细胞培养液（MEM + 10％FBS）将Matrigel基质稀释至5mg / mL。

    注意：整个实验过程中，与Matrigel基质接触的所有培养器皿、耗材和试剂均应始终置于冰上。

3.     使用预冷的枪头向预冷24孔板每个孔中加入100μL的Matrigel基质（5mg / mL），用枪头均匀铺开，37℃孵育30分钟形成凝胶。

    注意：在Matrigel凝胶过程中不要使其过度干燥。

4.     用胰蛋白酶消化单层MDCK细胞以制备单细胞悬液，室温下125×g离心5分钟沉淀细胞。

    注意：使用状态良好且不超过85％汇合度的细胞。MDCK细胞易于成团，通常需用移液器吹打以获得单细胞悬液。

5.     用MDCK完全培养液重悬细胞，调整细胞密度至5×106个细胞/ mL。取30μL制备的细胞悬液，加入到270μL置于冰上的Matrigel基质溶液（5mg / mL）中，最终细胞密度为5×105个/ mL。37℃孵育30至45分钟。

    注意：细胞悬液的体积不应超过Matrigel基质溶液的10％以上，以确保稀释的基质胶溶液能够凝结成胶。接种细胞数量可能需要根据细胞系的生长特性进行优化。

6.     轻轻地向每个孔中加入500μL MDCK完整培养液。

7.     继续培养8至10天，每2天更换一次培养液。

8.     建议对3D培养物进行免疫染色，使用共聚焦显微镜观察细胞形态。

培养结果

荧光染色后，共聚焦显微镜观察Matrigel培养的细胞，形成3D囊状结构

参考文献

1. Genee Y Lee, et al., Nature Methods. 4(4):359-365 (2007).

2. Natalie Elia, et al., Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4:Unit 4.22 (2009)