ELISA实验标本的采集/处理和保存

能够应用ELISA 实验的样本种类很多，有血清，血浆，细胞裂解液，细胞培养上清，尿液，肺泡灌洗液，脑脊液，各种组织匀浆等，每种样本采集和处理的方式都不相同。欣博盛市场部通过文献、试剂盒说明书和网友的经验，整理出以下方法仅供参考。

一 血清

1 采血后室温静置20min或更长时间至血清析出。

2 将采集的血液用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

大部分ELISA检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的 ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如在冰箱中保存过久，在间接法ELISA中可使本底加深。

二 血浆

1 取血后加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠等），混合10-20分钟后，30分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染（也可以直接用抗凝管采集）。

2 将采集血液用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。

三 尿液

1 采集尿液样本500ul，加入无菌试管中。

2 用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的样本小心收集上清，弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

四 细胞培养上清

1 用无菌试管收集细胞培养上清液。

2 用离心机4℃，2000rpm离心15min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。

3 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

五 细胞裂解液

1 取细胞培养板或细胞悬液，用PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板1-2次。

2 通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。

3 用离心机4℃，2000rpm离心20min左右，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。

4 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

六 组织匀浆

1 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。

2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天热时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织的小烧杯放入冰水中）。

3 匀浆的方式有多种：

a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

b) 机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

c) 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

4 将制备好的10％匀浆用离心机4℃，3000rpm离心15min，将离心好的匀浆小心收集上清，弃下面沉淀。

5 取上清并分装保存备用，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

保存时间

一般ELISA检测样本在2-8℃下，可放置保存24-48小时；-20℃下，可放置保存1个月；-70℃下，可放置保存6个月。