类器官冻存的绝妙好工具

肿瘤类器官模型作为极具潜力的临床前模型，在病理学研究，治疗方法开发以及药物敏感性检测方面有很多应用。因此，建立类器官生物样本库可以为类器官基础研究、药物开发以及个体化治疗提供更为可靠的工具。

建立类器官生物样本库对于类器官的冻存与复苏提出了很高的要求，在保证类器官最佳生长状态的前提下，优良的冻存培养基是类器官冻存与复苏成功的关键。

Corning KM Banker II（Corning Cat.No.88-702-CB）无血清冻存培养基以其优良的冻存复苏效果已成功应用于多种类器官的冻存，并且无须程序降温，可以直接冻存，省时又省力，本案例将详细介绍类器官冻存与复苏步骤。

肠癌类器官冻存步骤

注意: 肠癌类器官与正常肠类器官培养是有差异的，培养时间会更长，培养条件会更严苛；肠癌类器官状态不佳时，进行传代或冻存会影响后续观察性实验或导致复苏失败；因此冻存前的肠癌类器官必须处在最佳生长状态（即一般6-9天可以进行传代，传代成活率95%以上，例如图A,B）；其次优良的冻存液也是保证肠癌类器官复苏成功的必要条件。

肠癌类器官冻存前24小时更换新鲜类器官培养基；准备含有0.1%BSA 的冰PBS (Corning Cat.No.21-040-CV）；

对24孔培养板 (Corning Cat.No.3524)每个孔中的肠癌类器官数目进行计数，一般一支2ml的冻存管（Corning Cat.No.430659）冻存200-300个类器官；

去除孔中培养基，加入1ml预冷的含0.1%BSA 的PBS，轻柔吹打3-5次，将 Matrigel（Corning Cat.No.356231）从板底吹起并打碎，将悬液移入15ml离心管中；

将类器官在4℃，300-500 x g离心5分钟，去除上清，加冰PBS重悬，重复清洗过程3-5次直至胶去除干净；

最后一次离心后，将上清去除干净；依据200-300个类器官/500μl冻存液（Corning Cat.No.88-702-CB）比例加入相应体积的冻存液；

轻柔重悬类器官后取500μl转移入冻存管，标记好直接移入-80℃冰箱，无需冻存盒梯度降温；经此方法冻存的类器官可在-80℃短期保存1个月，长期保存可转入液氮罐中（请将冻存管存放于液氮罐的气相）。

肠癌类器官复苏步骤

冰上解冻Matrigel（Corning Cat.No.356231）；首次解冻请将原瓶埋在碎冰中于4℃冰箱过夜，并按单次用量分装，避免反复冻融；相应的肠癌培养基恢复到室温；24孔板置于37℃培养箱预热30分钟；

准备10%FBS   DMEM/F12 (Corning Cat.No.10-092-CV),准备0.1%BSA 的冰PBS及Y27632(10mM)；

向15ml离心管中预先加入5ml平衡至室温的含10%FBS的DMEM/F12 ，各离心管提前标记复苏的类器官；

从液氮罐中取出冻存管，37℃水浴锅解冻，解冻时间1-2分钟，最佳解冻状态为：冻存管中大部分为液体状态，中间稍微有一点冻滴，即冻存管中依然为低温状态（过度升温影响类器官活性）；

使用1ml枪头，将解冻的类器官悬液转入上述步骤3中的15ml离心管中；

类器官悬液4℃，300-500 x g离心5分钟，弃上清；

用0.1%BSA的冰PBS重悬类器官，轻柔吹打，4℃，300-500 x g离心5分钟，弃上清；

将200 μl Matrigel加入离心管中，上下吹打重悬均匀类器官，此过程尽量避免因吹打而引入气泡，否则会影响后续接种；

使用预冷的200ul枪头，加50μl类器官Matrigel悬液至预热的24孔板 (Corning Cat.No.3524)中，在每孔中心形成圆顶液滴，接种完成后放入培养箱5-10分钟使胶滴固化；

向已接种胶滴的培养孔沿壁加入500-750μl相应的肠癌类器官培养基，加液时勿直接冲击胶滴或沿壁加液速度过快而使胶滴脱离板底；

复苏后的首次加液时向培养基中添加Y27632（终浓度10μM），后续每3-4天换液一次（无需再添加Y27632），一般1-3周肠癌类器官可进行首次传代，依据传代效果可安排进行相应的实验。

注意事项

肠癌类器官复苏的关键在于：

冻存时肠癌类器官的活力状态；  

冻存液的有效性；

相适应的类器官培养基

   A:复苏后第1天；B：复苏后第4天；C：复苏后第7天；D:复苏后第10天；50X

   特别感谢：复旦大学放射医学研究所徐小雅老师实验室提供案例分享