iPSC重编程及培养方案

关于iPSC重编程及培养的方案如下：

1重编程：从外周血或者成纤维细胞起始

a"您需要从外周血重编程为iPSC的话，我们推荐两种高效的方式：

一种是从外周血中富集并扩增CD34+造血干祖细胞，然后重编程为iPSC，需要CD34+ Progenitor Reprogramming Kit

<http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/CD34-Progenitor-Reprogramming-Kit.aspx>；由于CD34细胞保持未分化的扩增能力有限，需要较多起始外周血；此试剂盒可支持80mL外周血重编程；

另一种是从外周血中富集并扩增红系祖细胞，然后重编程为iPSC，需要Erythroid Progenitor Reprogramming Kit

<http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/Erythroid-Progenitor-Reprogramming-Kit.aspx>；此试剂盒可支持10mL外周血重编程；

两种方法可参考网页Reprogram Blood Cells with ReproTeSR™<http://www.stemcell.com/en/Pages/Reprogram-Blood-Cells.aspx

b:体细胞起始(如成纤维细胞）

（1）：非整合重编程载体：ReproRNA-OKSGM（Cat#，05930）, ReproRNA™-OKSGM是自我复制的RNA，不是病毒，也不是DNA；目前在成纤维细胞的重编程效率方面，sendai仙台病毒约为0.2%，ReproRNA™-OKSGM约为0.1-0.3%，效率相当；传统的4个因子的产品如Simplicon(Millipore)，效率只有0.01%，ReproRNA™-OKSGM含有5个因子，效率高约10-30倍；试剂盒包含转染试剂，不需要电转等仪器；安全性方面，是RNA，不是DNA，不会整合入基因组；稳定性方面，目前检测过核型，重编程后未发现核型改变，可参考下列第二个链接或第一个产品链接的data部分；可自我复制，不需要重复转染，转染一次即可；由于是RNA，所以接触的枪头、Eppendorf管需要RNase free，试剂盒的RNA需要储存在-80°C，转染试剂需要储存在2-8°C；ReproRNA™-OKSGM重编程细胞量是仙台病毒的2倍，成本更低。可搭配ReproTeSR培养基使用，长出的iPS克隆形态更佳，更易挑取。

ReproRNA™-OKSGM网页链接为：

http://www.stemcell.com/en/Products/All-Products/ReproRNA-OKSGM.aspx

ReproRNA™-OKSGM产品介绍可参考：

http://www.stemcell.com/~/media/Technical%20Resources/D/E/4/4/2/DX20456ReproRNA.pdf?la=en

ReproRNA™-OKSGM产品说明书请参考：

http://www.stemcell.com/~/media/Technical%20Resources/2/4/9/2/C/DX20362.pdf?la=en

（2）：重编程培养基：TesR   E7(Cat#，05910）成分明确，不含异种成分，无需饲养层条件，完全培养基。

2.iPSC维持培养产品*

iPS培养基我们推荐STEMCELL 的金标产品cGMP mTeSR1(Catalog #85850)这是一款无需饲养层hPSCs的无血清维持培养基，成分确定效果稳定，目前已有超过1500篇文献引用。Kit包含400ml基础培养基以及100ml 5X添加物，不需要添加其他细胞因子。如果采用单细胞传代我们建议客户可以选择将CloneR(Catalog #05888, 1 x 10mL,见附件)添加到培养基中。

3.贴壁基质*

1）Vitronectin XF™（Catalog # 07190）是化学成分确定、无异种成分，含人重组蛋白。使用方便，室温即可包被。

Note：需使用无组织处理的培养器皿

2）Matrigel（Catalog # 354277，BD ）是一种小鼠肉瘤提取物，成分不确定，批次间差异较大，我们推荐经过STEMCELL检测的354277货号。*两种基质使用差异详见附件*。

5.传代与冻存*

STEMCELL目前拥有三款传代解离试剂：

1）ReLeSR（Catalog # 05872,100ml ）不含动源成分，不含酶，无需手工选取或刮擦，可生成最适合大小的细胞聚集体。使用时为了达到理想状态（分化的细胞不会解离下来），我们建议利用预实验确定最佳温度及消化时间。产品目录价为RMB514。详细请咨询经销商；

2）温和细胞解离剂（GCDR，Catalog # 07174），ACF（无动物源成分），化学成分确定不含酶，只需调整孵育温度，既可解离为细胞团块，也可解离为单个细胞；消化前需要手工剔除分化部分，

分化前解离为单个细胞时使用

在mTESR1和Vitronectin-XF上培养的细胞我们建议使用GCDR，STEMCELL有实验测试。

3）分散酶（Catalog # 07923）是含酶试剂，可用于无饲养层条件的传代。

3 冻存液

STEMCELL冻存液包括两种：

1）mFreSR™成分确定，无血清，且优化用于在TeSR™维持培养基中培养的细胞。与使用血清的传 统方法相比，存储在FreSR™冻存液中的细胞具有更高的解冻效率。mFreSR™无血清冻存液优化用于将hPSCs冻存为细胞聚集 体。目前50ml规格目录价2962，详情咨询经销商；

2）CryoStor® CS10（Catalog # 07930）无动物源成分，使用USP级成分以cGMP标准生 产，在FDA有备案。可保持细胞的高活性，并使hPSC细胞在经过长期存储后复苏率最大。CryoStor® CS10含有10%二甲基亚砜（DMSO），在细胞和组 织的冷冻、储存和解冻过程中为其提供安全的保护性环境。100ml目录价2940。建议建立干细胞平台使用通过cGMP认证的CS10。

6 分化相关：

STEMCELL 有中胚层分化，外胚层及Neruo分化，及内胚层分化试剂盒，需要了解客户的具体需求再做方案推荐。