如何解决原代细胞培养过程中的10大问题

来源：赛默飞

应如何进行冻存细胞的培养？

下列步骤以单管冻存细胞进行培养的实验方案为例。

准备一烧杯37°C的水。
从液氮储存中取出一管细胞，注意保护手和眼睛。
拧松管盖1/4圈，等待10秒钟以释放螺纹中可能残留的液氮，再重新拧紧管盖。
将冻存管的下半部分置于37°C水浴中进行解冻，直至冻存管内仅剩余一小块冰芯，使细胞迅速解冻。
用消毒液擦拭管体外表面，再将其移至II级A型层流细胞培养通风橱中。
打开管盖，使用1 mL移液器上下吹打细胞悬液以分散细胞。
从管中吸取20 uL细胞悬液，并将其稀释于20 uL台盼蓝溶液中（如：Gibco™台盼蓝，货号 15250-061）。
使用血细胞计数板来确定每毫升悬液中的活细胞数。
将管中悬液（1 mL）稀释至产品说明中的推荐浓度（例如1.25 x 10E4活细胞/毫升，Gibco™ 新生人表皮角质形成细胞）。
将5 mL细胞悬液加入25 cm2培养瓶，或将15 mL细胞悬浮液加入75cm2培养瓶中。
摇匀培养瓶中的培养基以彻底分散细胞。许多类型的细胞都会迅速贴壁，如果没有在传代后即刻摇匀细胞，细胞可能生长不均匀。
在37°C、5% CO2/95%空气、湿度细胞培养箱中培养细胞。为了获得最佳结果，培养开始后至少在24小时之内不要扰动细胞。

是否可以对扩增后的细胞重新冻存？如果可以该如何操作？

当从Thermo Fisher Scientific购买了Gibco™或Invitrogen™冻存或正处于增殖期的细胞，可对其进行扩增和重新冻存。不过，冻存操作可能会对细胞的生长状态有所影响。下列实验方案为您提供了一份使用Synth-a-Freeze™培养基冻存细胞的基础指南，Synth-a-Freeze™培养基是Thermo Fisher Scientific旗下的一款成分确定，无蛋白成份的冻存培养基。

请注意：由于冻存设备与个人技术之间的差异，我们无法保使用本方案冻存的细胞在复苏后能够保持活力，我们也无法为研究用户实验室冻存细胞的效果进行担保。

使用37°C水浴化冻Synth-a-Freeze™培养基或4°C条件下过夜化冻。
如果在水浴中进行化冻，请确保温度不要超过37°C，也勿将该产品延长时间置于37°C。
Synth-a-Freeze™培养基在使用前应置于4°C条件下彻底平衡。为获得最优结果，推荐客户使用能够控制变温速率的冰箱。如果缺少能够控制变温速率的冰箱，也可使用细胞冻存盒（如Thermo Scientific™ Mr Frosty™ container)。
如需用酶试剂解离培养器皿表面的细胞，则需使用对应的终止溶液重悬细胞以中和酶的效果。
通过离心沉淀细胞。
去除上清液后，使用预冷的Synth-a-Freeze™培养基以5x10E5至3x10E6细胞/毫升的密度重悬细胞。
将细胞悬液分装至合适数量的冻存管中。
将细胞尽快冷却至4°C。
如果使用控制变温速率的冰箱：以每分钟降低1°C的速率冰冻样品，直至–40°C。之后按照每分钟降低2°C的速率降至–90°C左右。
如果使用细胞冻存盒：请按照说明书来准备冻存盒。
为获得最佳结果，我们推荐您在细胞温度降至–80°C后，尽快将冻存管转移至液氮储存设备的气相中。
作为Synth-a-Freeze™培养基的替代品，可使用该冻存细胞推荐的基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS）和10% DMSO进行细胞冻存。请注意不推荐将Synth-a-Freeze™培养基用于人表皮黑素细胞的冻存操作。

是否需要在种板前离心细胞以去除冻存培养基？

我们不推荐在种板前离心细胞以去除冻存培养基。尤其是在不适当的高速条件下，离心对细胞有损伤。以我们Invitrogen™细胞培养实验室目前经验的来看，如果DMSO的浓度足够低，不会对细胞造成伤害。因此，我们的产品说明中提供了一份详细方案，其中包括如何使用推荐的接种密度和培养基的体积稀释细胞使得DMSO的终浓度低于0.4%（v/v）。

群体倍增数与传代数目之间的区别是什么？

群体倍增是培养体系中细胞总数的翻倍过程，在指数或“对数”生长期最为常用。

传代数目是指将细胞群体从培养容器中取出和传代的次数，这是为了将细胞保持在足够低的密度，以促使其进一步生长。在Invitrogen™细胞培养的定义中，组织分离得到的细胞的首代培养物称为原代培养。首次传代后的细胞称为第二次培养物（或第1次传代， passage 1）。第二次传代后的细胞则称为第三次培养物（或第2次传代，passage 2），以此延续下去。

为何我的原代细胞生长变慢或停止生长？

原代细胞未经永生化处理，因此群体倍增次数有限。每一种细胞类型都拥有不同的最大群体倍增次数，这一参数可在产品指定批次的COA（certificate of analysis）上找到。

粘附细胞培养与悬浮培养之间有何区别？

您正在使用不含动物源性成份（AOF）的添加剂来培养细胞，请确保使用了包被基质试剂盒。AOF添加剂中不含粘附因子，而包被基质试剂盒能够为细胞提供所需的粘附能力。

为何我的细胞无法依附于培养板/培养瓶表面？

从冰箱中取出血清并在2–8°C条件下过夜融化。随后可在室温下完成解冻过程。在这一过程中，血清应规则地进行混匀。

警告：不要将FBS置于37°C条件下孵育过长时间，否则产品可能会变混浊。由于血清中许多成份存在敏感性，其性能也可能受到影响。产品一旦解冻，建议您立即使用。

为何我的原代细胞复苏后存活率如此之低？

收货后立即将细胞保存于气相液氮中很重要。这些冻存管并不能确保不发生渗漏，将它们浸入液氮的液相中可能会使液氮渗入管中，进而影响细胞活力。

在角质形成细胞培养物中观察到大型扁平的烤饼样细胞。这是什么类型的细胞？

这些是衰老细胞，它们在成体角质形成细胞培养物中很常见。通常情况下培养物中会有一群衰老而不再增殖的细胞。而年轻细胞的个体更小，仍能够继续分裂。当培养物逐渐衰老，您就会观察到越来越多的大细胞，培养物最终也将停止生长。在正确培养和维持的情况下，这些培养物至少能够完成25次的群体倍增生长。

Q10

在复苏角质形成细胞后将他们种在少量培养瓶/培养板中，现在观察到里面有许多漂浮的细胞。为何会发生此种情况？

在接种细胞之前，请务必进行一下细胞活力计数，并按照推荐的接种密度进行接种。一些实验方案中提及的培养瓶数量是一个参考指标，您可据此估计每一管冻存细胞大致需要多少个培养容器。管子上的细胞数量是最低保证，，但一般都会多提供一些以确保您能收到我们承诺的细胞数量。也就是说，细胞计数对于保障准确的接种密度是至关重要的，这样您也就可以有效监控细胞生长的群体倍增次数了。